:::

主題研究

    • 計畫名稱:

      海洋天然物研究

    • 研究人員:

      宋秉鈞(計劃主持人)郭傑民呂美津蘇瑞欣

    • 子計畫:

      • 1.海洋無脊椎動物及養殖型八放珊瑚所含天然物化學成分之研究 (宋秉鈞)
      • 2.養殖型軟珊瑚所含抗發炎天然物的探討和海洋天然物抗類風濕性關節炎之功效與機轉的研究 (蘇瑞欣)
      • 3.海洋天然物抗癌活性之篩選及其作用之評估 (呂美津)
      • 4.產天然物海洋微生物篩選 (郭傑民)

    • 計劃說明:

      海洋天然物的研究已持續五十多年。從樣品的採集、萃取、純化到最後的生物活性篩選,已從海洋生物(細菌、真菌、微藻、海草、海綿與珊瑚)中分離出三萬餘個化合物。由於海洋環境的特殊性,使海洋生物代謝產生獨特化學骨架的化合物,生物活性良好同時具有藥物開發潛力,迄今全球已有八個海洋天然物進入醫藥領域,其中包括抗病毒藥物cytarabine與抗癌藥劑halichondrin等。根據未來在藥物領域發展的市場需求下,海洋天然物研究團隊以環境保育與延續研究的原則下,建立海洋無脊椎動物人工繁養殖技術,穩定量產海洋天然物,藉此推廣海洋生態保育的重要性。除海洋生物養殖外,我們亦對海洋微生物參與海洋無脊椎動物產天然物上進行研究,利用微生物轉化,或以微生物替代生產天然物與前驅物,在微生物可大量培養優勢下,獲得穩定且多樣性的海洋天然物增進海洋天然物研究的深度與廣度。

    • 計畫內容:

      子計畫

      壹、海洋無脊椎動物及養殖型八放珊瑚所含天然物化學成分之研究 - 宋秉鈞
      一、計畫緣起
      海洋表面積約佔地球表面積為71%;而海洋平均深度為3,785公尺,太平洋馬里亞那海溝當中的查林傑海淵 (Challenger Deep)是海洋最深地區深度有11,034公尺,形成99%的生物棲息體積,是整個地球上最大的生物棲息空間,造就了非常豐富的海洋生物資源;生物多樣性豐富的珊瑚礁生態系統並提供了食物來源及繁殖棲息場所,可以維持漁業資源;在海岸線保護上,健康的珊瑚礁有如自然的防波堤,可減低約70~90 %的海浪沖擊;珊瑚礁生態系形成千變萬化且色彩繽紛的海底世界,吸引各地潛水觀光客,為重要的觀光資源,海洋生物經由長時間的演化,可提供人類食用、醫藥與休憩上等多項功能;而海洋生物是海洋藥物研究和開發的基礎,近數十年來海洋水下技術的日新月異,人類慢慢的揭開海洋這神秘「內太空」的面紗,找尋有別於陸地生物的活性成份,經過天然物學家的努力,其所含活性天然化合物可透過半合成、化學結構修飾、全合成或官能基修改等途徑,研發成高效、低毒的海洋生物藥物。目前而言,海洋生物的來源和量產往往是是藥物研發的兩個重要限制性因素,海生館在生物地理處於得天獨厚的恆春半島,且經過多年的深耕,已建立多種海洋生物的繁養殖系統,特別是微生物、海綿和八放珊瑚等海洋生物,而這些物種也是被科學家認為是海洋當中具有活性潛力的天然化合物的主要來源,藉由海生館天然物團隊研究員彼此間的合作與館內資源活用,可以在研究上組成海洋藥物篩選的上中游架構,與透過產業合作建立模式商品推廣,同時建立南臺灣海洋藥源生物穩定供給,作為海生館的發展特色之一,重要的是與海洋生態保育做結合,改變依附於自然資源取用的限制,藉由這些關鍵性的突破,帶動海生館在藥用海洋生物的發展。

      二、目標與執行
      (一)目標
      計畫選定繁殖型的台灣本土軟珊瑚所產活性物質作為研究對象,並發展其在醫藥上的應用,以藥物開發為出發點,建立中大型人工繁養殖量產相關天然活性添加物原化合物,主要實驗目的為建立珊瑚養殖池量產特定珊瑚,評估珊瑚生長狀況,建立物種之親源關係以確立生物品系可信度及抽提液原料中指標成分確認之分析方法,於珊瑚產生大量指標成分的時節進行珊瑚之採收,隨後將採收的珊瑚樣品以不同有機溶劑比例進行實驗,建立能精確將指標成分大量得到之萃取方法進行初步溶離,並得以粗萃取物秤重紀錄,同時建立檢驗方法之SOP與指標成分資料庫,並與團隊其他研究員合作,健全已有的合作模式,建立從微生物篩選方法開發,建立微生物所產特定天然物發酵模式,在天然物純化分離方面則是建立在生物樣品中之活性化合物的定性與定量方法,追蹤養殖型珊瑚生長及所產活性天然物狀況,也建立野外型珊瑚含活性天然物資料庫,做為日後養殖物種種類及數目上的擴大之指標,在生物活性篩選則與呂美津研究員進行合作,增加抗癌活性篩選平台的增加,並將化合物或萃取物與外校研究單位進行學術合作增加不同生物活性的篩選。
      (二)執行方式
      養殖型及野外型八放珊瑚天然物分離及分析: 找尋墾丁周圍海域具活性天然物種源珊瑚,進行軟珊瑚採集,經由初步萃取與生物活性篩選,出萃取物具活性者,並建立該物種中小量養殖系統,評估其大量養殖可行性,再依一般天然物化學實驗方法加以執行,有機溶劑萃取(粗萃取物活性檢測)、層析分離、圖譜測定、化合物結構解析、衍生物製備及純化合物生物活性檢測等步驟依序進行,過程中並佐以儀器輔助如HPLC 在分離上的應用以及高磁場NMR 的圖譜測定,並對所得到的化合物養殖型與野外型八放珊瑚所含天然物成分之比較,同時進行結構上的局部修飾(modification),以系統性的方式進行衍生物的製備,除有助於新化合物的結構解析之外,亦期望能對化合物在SAR 關係上的了解有所幫助。

      貳、養殖型軟珊瑚所含抗發炎天然物的探討和海洋天然物抗類風濕性關節炎之功效與機轉的研究 - 蘇瑞欣
      一、計畫緣起
      煙草烷類化合物常見於軟珊瑚的二次代謝物,而這類化合物在過去的實驗中常表現出顯著的抗發炎活性,如化合物sinularin可緩解傷害性反應和神經發炎現象;化合物11-epi-sinulariolide acetate在佐劑誘發關節炎模式中,可抑制發炎反應與改善關節的損壞;化合物flexibilide具有抗神經發炎和鎮痛作用,此外煙草烷類化合物也證實可藉由調控樹狀細胞,亦有免疫調節功效。在本館養殖型柔軟指形軟珊瑚 (Sinularia flexibilis) 及粗厚葉形軟珊瑚 (Lobophytum Crassum) 中常見這類煙草烷類化合物,也從中發現三個化合物 sinulariolide、11-dehydrosinulariolide及sinularin 在不具細胞毒性劑量下,具有顯著抑制LPS誘導樹狀細胞分泌促發炎激素IL-12 的能力。並藉由抑制樹狀細胞 CD80 及 CD86 表現,限制其抗原呈現能力。海洋煙草烷類化合物通常擁有多個掌性中心(chiral center),因此在合成的難易度及成本都相對較高,因此從養殖型軟珊瑚中取得是一個有效的方法,本團隊在過去幾年對人工養殖珊瑚的技術上已建立相當基礎,也利用養殖型珊瑚進行研究並發表數篇活性天然物論文,故目前將利用人工養殖來獲得更大量之生物物種,進一步取得活性天然物,進行更進一步的機轉討論及動物試驗。藉由館內海洋天然物團隊研究員彼此間的合作與館內資源活用,建立海洋藥物平台一條龍的系統,可從生物養殖、天然物萃取純化及分離、活性篩選、機轉討論及動物試驗,並一路推動到臨床初期,並藉由此項利基對外與產業合作,輔導廠商進行技術轉移,推動海洋藥物及海洋藥用生物原物料的特色發展。

      二、目標與執行
      (一)、目標
      計畫選定以兩種養殖型軟珊瑚,柔軟指形軟珊瑚 (Sinularia flexibilis) 及粗厚葉形軟珊瑚 (Lobophytum Crassum) 所含天然物的研究,並針對所得到的天然物以樹突細胞作為免疫調節分析平台,評估其天然物是否具有免疫調節功效並分析其詳細分子機制。進一步將挑選具有良好免疫調節功效的天然物,以第二型膠原蛋白誘導關節炎小鼠模式,進行抗類風溼性關節炎之功效評估。期望於本計畫中篩選出具有免疫調節功效的新穎性天然物,為抗類風濕性關節炎提供新穎性治療策略。
      (二)、執行方式
      1.珊瑚養殖
      利用0.6噸缸進行目標珊瑚母株的分株切割,將分株以釣線固定在磁磚上,放置於缸體一至兩星期等分諸自然附著,接下來移入4噸至30噸水體缸利用懸掛式養殖,進行珊瑚放大。
      2.化合物純化分離及結構鑑定
      珊瑚樣品先以冷凍乾燥機去除水分,以研磨機將樣品打碎,打碎後使用乙酸乙酯溶劑進行重複多次萃取至樣品無顏色攜出,並將萃取物抽乾秤重。將前述所得之乙酸乙酯萃取物進行色層分析法純化分離。預計利用管柱層析(Column chromatography)、高效能液像層析(HPLC chromatography)等純化分離方法。取得純化合物後利用核磁共振儀、質譜儀、旋光光度計、紅外線光譜儀等分析儀器進行化合物結構確認鑑定。
      3.活性分析
      (1).評估免疫調節功效:以小鼠骨髓分化之免疫樹突細胞作為分析平台,探討天然物調結束樹突細胞活化之功效及詳細分子機轉。
      (2).評估改善骨骼生合成失衡:以小鼠骨髓分化之蝕骨細胞作為分析平台,探討海洋天然物對於蝕骨細胞(osteoclast) 分化之影響及詳細之分子機制。
      (3).評估抗類風濕性關節炎功效:以第二型膠原蛋白誘導關節炎小鼠模式,探討天然物應用於治療類風濕性關節炎之潛力及詳細之細胞及分子機轉。

      參、海洋天然物抗癌活性之篩選及其作用之評估 - 呂美津
      一、計畫緣起
      天然物長久以來都是傳統藥物的來源,至今仍然被視為最具潛力藥物來源。於1940至今,市面上60%的藥物都來自於天然物,用於癌症治療上更高達85%的藥物為天然物或是天然衍生物。然而,至目前所知的33個動物門類中有15個門類只生存於海洋中。許多海洋無脊椎動物為軟體動物,因此必須依靠化學防禦幫助他們抵禦掠食者,於是具有多元的二次代謝物(也稱為天然物),儘管海洋具有獨特的生物多樣性與多元的天然物來源。但由於技術的限制,直到1951年,由Werner Bergmann陸續從海綿分離與鑑定出spongouridine(vidarabine)和spongothymidine(cytarabine),並在日後發展為臨床抗癌藥物。並且於1969年首度發現海鞘之萃取物trabectedin具有抗癌作用,被核准治療軟組織肉瘤(soft tissue sarcoma),隨後也被用於治療乳癌、前列腺癌和卵巢癌。於2007年統計,在抗癌藥物發展上有17種海洋天然物於臨床試驗中,並且其中有2種海洋天然物被美國食品和藥物管理局(Food and Drug Administration, FDA)及歐洲醫藥產品評估(European Agency forthe Evaluation of Medicinal Products, EMA)核准用於治療癌症。這些具有療效之海洋天然物大部分來自於海綿、藍藻與藻類,而具有潛力成為藥物之化合物主要來自於海綿與軟體動物,其中主要從海綿所萃取之天然物佔大多數。在現今的海洋天然物中,有3種海洋天然物與5種海洋衍生物被證實具有醫療效果,包含4種抗癌、1種抗疼痛、1種降三酸甘油血症與2種抗病毒,此外也有28種海洋天然物目前於臨床試驗階段。台灣對於海洋天然物之研究也具有相當的知識與技術。加上台灣四面環海,同時也位於全球海洋珊瑚密度與多樣性最高之處。因此,南台灣極具有優勢從事於海洋天然物之研究。

      二、目標與執行
      (一)、目標
      本計畫建立一套完整研究體系將針對海洋微生物二次代謝產物研究,一系列地從海洋微生物純化分離與培養、二次代謝產物化學結構解析及抗癌活性試驗篩選,以期未來可將具有顯著地活性天然物候選藥物發展進入抗癌前臨床試驗。將研發資源整合運用,結合化學、微生物及生物活性之研究,天然活性物質及新藥,以及將之成分分離及其結構解析的方法,再配合基因體、蛋白質體、細胞、動物體等階層之實證檢測方法來評估海洋天然物的抗癌活性,配合特定動物疾病模式以提供中藥理效用根據,最後進一步新藥臨床試驗之相關驗證與規範,以利提供新藥開發之藥源。
      (二)、執行方式
      1.培養海洋微生物以提供具有抗癌活性二次代謝產物之萃取物
      篩選海洋生物(珊瑚、海綿與各種生物及底泥)之伴生微生物,本癌細胞毒殺預試驗結果,發現從一百多種微生物萃取物中,篩選出超過60種對多種癌細胞具有顯著性的毒殺作用。因此,本計畫將大量培養具有相當潛力之微生物萃取物,以提供進一步化學及抗癌活性試驗。
      2.利用生物活性導引分離法分離純化出抗癌活性之海洋天然物
      利用細胞毒殺活性導引分離法得到具有抗癌作用之活性天然物,利用核磁共振(NMR,Nuclear Magnetic Resonance)技術原理,鑑定活性化合物之化學結構。利用高效液相層析儀(HPLC,High-performance Liquid Chromatography)可用作液體混合物中的成份分離及藥物成分定性及定量分析,藥物分子即時光譜分析,因此,純化分離且確認鑑定出海洋活性天然物。
      3.利用細胞及動物試驗檢測其抗癌活之作用機制
      建立細胞體外試驗及人類癌細胞異植動物試驗檢測所分離純化之抗癌活性天然物對癌細胞之毒殺作用,進一步探討其抗癌機制是否與又發炎細胞凋亡及DNA受損有關。利用活性天然物處理治療後之腫瘤組織以微陣列(microarray)分析其蛋白質及基因與對照組處理比對下,以確立藥物作用之分子標的,以利應用於前臨床試驗之發展。
      4.利用發酵培養條件最佳化以提供量產抗癌活性候選藥物之平台
      建立大量發酵培養技術為平台,利用活性天然物之生物量為評估要點,找出發酵條件最適化,利用化學合成提供化學結構上之修飾,以彌補海洋天然物之毒性,應用於臨床試驗之評估,且更進一步可提供藥廠製造抗癌藥物之依據。

      肆、產天然物海洋微生物篩選 - 郭傑民
      一、計畫緣起
      抗生素是微生物生產的重要二次代謝產物,對於人類醫藥的進步有極大的貢獻。近年來,有越來越多的病源菌對現行所使用的抗生素產生抗藥性,使得對於新抗生素的需求不斷增加,在陸地資源越來越難發現新穎抗生素的現今,許多科學家逐漸轉向海洋資源,海洋微生物勢必能成為新型抗生素的重要來源。但近年來對於產抗生素微生物(特別是放線菌)的篩選卻有著重複發現已知抗生素的困擾,解決此一問題或許可以從新發現且較少人研究且有潛力的新菌屬-Pseudovibrio屬菌著手。
      Pseudovibrio屬菌由Shieh等人(2004)於台灣墾丁國家公園南灣附近的海水,首次分離出具有脫氮(denitrifying)能力的Pseudovibrio denitrificans,並確定為新屬,隨後又陸續有不同學者分別於海鞘、海綿與海水發現三株本屬的新種(Fukunaga, et al., 2006, Hosoya and Yokota, 2007, O'Halloran, et al., 2013)。由許多不同的研究顯示,Pseudovibrio屬細菌廣泛存在於各種不同的海洋生物表面(如:海鞘、珊瑚與海綿),並可生產具有抗菌活性的二次代謝產物,且具有廣效的抗菌能力,可以抗多種細菌與真菌(Bondarev, et al., 2013)。有些與海綿共生的Pseudovibrio屬細菌甚至佔該海綿所分離到具有抗菌活性細菌的70%左右,顯示其大量存在於宿主,其二次代謝物極具有研究的價值。由於目前對本屬細菌的研究還很少,其二次代謝產物也很少被研究,因此吾人認為有必要對此屬的細菌做比較完整的研究,以瞭解其分布情形、多樣性、二次代謝物活性與其產生機制。

      二、計畫目標與細部規劃
      (一)目標
      過去的研究顯示Pseudovibrio屬細菌廣泛存在於各種不同的海洋生物表面(特別是海綿),並可生產具有抗菌活性的二次代謝產物,且具有廣效的抗菌能力,可以抗多種細菌與真菌。但由這些研究都注重在海洋無脊椎動物伴生Pseudovibrio菌,先前基因體的研究已證實本屬菌代謝的多樣性與可適應貧營養的環境。因此,吾人認為海底沈積物中應該也有本屬菌的存在,希望經由有系統的篩選,可以證明此一論點。
      (二)執行方式
      由臺灣南部海域不同生態與環境系統,採集海底沈積物,分離與培養所含Pseudovibrio菌,測試其抗菌活性、海水需求性與細胞毒殺(MTT assay)活性(委由呂美津老師實驗室進行)。萃取基因體DNA,進行菌株16S rRNA基因多樣性分析。最後,進行活性導向的二次代謝物純化與化學結構鑑定(委由宋秉鈞老師實驗室進行)。

    • 相關圖片
      1. 海洋天然物研究
      2. 海洋天然物研究
      3. 海洋天然物研究